实验问题与解决方案

◆1怎样避免sgRNA脱靶?

脱靶效应与sgRNA的精确设计有着密切的关系，一般的sgRNA设计网站都会给出设计序列相应的脱靶位点、GC含量或综合得分，我们一定要选择综合得分高和脱靶位点少的sgRNA序列，且一般至少设计3条sgRNA。

◆2怎样选择CRISPR系统？

如果要靶标多个基因位点，建议您选择CRISPR-cpf1系统，这个系统的sgRNA只有40多bp，比普通Cas9蛋白的sgRNA要小一半以上，一个sgRNA载体可同时插入多个sgRNA。

如果要更精确的编译基因组，建议选择Cas9 nicknase，这个蛋白是Cas9的突变体，只切割DNA的一条链，因此，这个系统需要设计两个sgRNA，同时切割，才能产生DNA双链缺口。同时，这种方法大大降低了脱靶效应。

◆3 Cas9的单切系统和双切系统是什么？

Cas9的双切系统是未突变的Cas9内切酶，Cas9内切酶可以切割双链DNA。Cas9

的单切系统使用的是单突变Cas9内切酶，即Cas9 Nicknase，Cas9 Nicknase需要两套才可以切割双链DNA。

◆4 怎样选择CRISPR系统的质粒？

 如果您的细胞的转染效率较高，可使用普通载体，如果您的细胞不容易转染，建议使用腺病毒或慢病毒载体。

• 1 . CRISPR-Cas9系统
  • 1.1. CRISPR-Cas9组成
  • 1.2. 作用机制
  • 1.3. 不同的Cas9系统
  • 1.4. Cas9-基因敲除
  • 1.5. Cas9-敲入系统
• 2 . CRSPER- dCas9系统
  • 2.1. dCas9-转录调控系统
  • 2.2. dCas9-基因激活与抑制系统
  • 2.3. dcas9-表观遗传系统
• 3 . dCas9技术路线
  • 3.1. gRNA设计
  • 3.2. dCas9实验流程
  • 3.3. 实验问题与解决方案