CRISPR-Cas9-基因敲除系统（knock out）

实验原理：

       CRISPR-Cas9基因敲除系统是Cas9内切酶切割双链DNA，生物体启动NHEJ修复途径，切割位点产生移码突变，导致基因沉默。

NHEJ修复途径是一种错误倾向修复机制，用于在缺少修复模板的情况下修复断裂的双链DNA。该途径主要用于CRISPR Cas9系统介导的基因沉默。主要用于当DNA发生断裂时，NHEJ修复途径被开启，DNA断裂处插入或缺失几个碱基，然后双链DNA的切割末端连接在一起，这个过程极容易导致切割位点发生移码突变，从而沉默该基因（图3）。因此，在沉默编码基因时， gRNA应靶向基因的N端来确保最大程度的基因破坏。

实验流程：

      1.设计sgRNA

      2.构建sgRNA-Cas9载体

      3.构建sgRNA-Cas9稳转株

      4 .筛细胞克隆并进行qPCR验证

      5 .阳性克隆测序，选择敲除純合细胞株

      6 .筛选细胞单克隆测序

实验步骤：

   ➤ 1、设计sgRNA

    针对小鼠LIF基因座（Mus musculus，NM_008501）设计了三种sgRNA。 进行软件分析以确保sgRNA没有预测的脱靶结合位点。

   ➤ 2、构建sgRNA-Cas9载体

      然后将选择的sgRNA设计克隆到pLenti-U6-sgRNA-SFFV-Cas9-2A-Puro All-in-One lentivector中（图1）。

图1 sgRNA-Cas9载体图谱

   ➤ 3、构建sgRNA-Cas9稳转株

  利用慢病毒包装体系构建sgRNA-Cas9稳转株，进行嘌呤筛选

   ➤ 4、 筛细胞克隆并进行qPCR验证

   嘌呤霉素筛选后分离细胞克隆。 提取基因组DNA并进行验证测定目的基因座是否进行编辑.

图2 qPCR检测基因组编辑情况。在野生型（WT）测定中的单个条带表示没有发生编辑; 两个较小的条带（总和WT的长度）表示编辑已经发生。图2表明，克隆 3和6编辑; 克隆2没有编辑; 克隆1是不确定的。

   ➤5 、阳性克隆测序，选择突变细胞株

   通过Sanger测序进一步分析细胞集落3和6的PCR产物以确定敲除的性质（图3）。

图3 细胞基因组测序结果。对于细胞集落3，只检测到一个突变序列，表明这些细胞可能只是杂合敲除。 在菌落6中检测到两种不同的突变序列。

   ➤ 6 、筛选细胞选择单克隆純合突变细胞株

将菌落6连续稀释到96孔板中进行单克隆选择。 从这些克隆（即6a，6b ..）中提取基因组DNA，进行PCR扩增，克隆和测序。

 图4细胞基因组测序结果。测序显示，在两个等位基因中只有克隆6a具有移码突变（图4）。 移码突变破坏了开放阅读框架，导致无意义介导的mRNA。

   ➤ 7.进一步测序，确定純合突变

图5 细胞基因组测序结果

• 1 . CRISPR-Cas9系统
  • 1.1. CRISPR-Cas9组成
  • 1.2. 作用机制
  • 1.3. 不同的Cas9系统
  • 1.4. Cas9-基因敲除
  • 1.5. Cas9-敲入系统
• 2 . CRSPER- dCas9系统
  • 2.1. dCas9-转录调控系统
  • 2.2. dCas9-基因激活与抑制系统
  • 2.3. dcas9-表观遗传系统
• 3 . dCas9技术路线
  • 3.1. gRNA设计
  • 3.2. dCas9实验流程
  • 3.3. 实验问题与解决方案