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3D模型验证技术

3D模型验证技术


基因组模型构建完成后,我们需要对模型进行验证。主要从两个方面对模型进行验证,一个是模型结构进行验证,一个是对模型功能进行验证。对模型结构验证,我们也是从两个方面进行验证,一个利用DNA FISH对模型的空间定位进行研究,一个是利用3C对模型的空间结构进行验证。对模型的功能验证,我们主要利用CRISPR技术去除模型结构,观察对应基因及细胞代谢的变化。



DNA FISH-模型空间定位验证


DNA FISH的基本流程与RNA及蛋白FISH相似,但DNA FISH探针要求更加严格,且细胞内的DNA及探针均需要变性。DNA FISH是观察细胞核中DNA分步,这需要更高放大倍数的共聚焦显微镜。

fish技术流程-01.jpg


如下图所示,在母本染色体中,三个基因是分开的,在父本染色体中,3个基因经过环形折叠在一起。

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3C-模型空间结构验证


3C的基本流程如下图所示。染色质先进行交联,交联后酶切,连接,再进行QPCR检测。3C技术主要捕获的是两基因间的互作,因此这种技术常用来验证基因间的互作。


3C技术流程-01.jpg


下图所描述的是基因promoter区与增强子区的互作验证,我们可以看到FIP1L1914kb处的增强子有互作。

 

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CRISPR-模型功能验证


我们利用CRISPR 技术敲掉CTCF motif,使CTCF无法结合,基因组的3D结构模型被破坏,相应基因的表达受到影响,细胞功能也可能会受到影响。CRISPR的功能是强大的,您可以根据您的需要敲除增强子,沉默子,绝缘子,甚至基因。

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CTCF位点被定点敲除


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酶切检测敲除效率



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PCR检测位点敲除后的基因变化


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位点敲除后的功能检测


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