一. 细胞裂解液获取

A. 单层细胞或者贴壁细胞处理

1. 冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次

2. 加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来，收集至enpendoff管

3. 1500rpm，4℃离心5min，弃上清，收集细胞

4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后于冰上静置5min

5. 每管分装200ul细胞裂解液，贮存于-80℃

B.  悬浮细胞处理：先收集细胞再计数，然后清洗裂解

C.  组织样品处理

1.冷PBS清洗新鲜切下的组织三次

2. 加入冷PBS后，用匀浆器或其他细胞分离设备使组织分散为单个细胞，计数

3. 1500rpm，4℃离心5min，弃上清，收集细胞

4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后置于冰上静置5min

5. 每管分装200ul细胞裂解液，贮存于-80℃

二.  磁珠的准备

A. 实验前准备

1、enpendoff管

2、磁力架

3、冰盒， RIP Wash Buffer置于冰上

4、抗体，置于冰上

5、涡旋震荡器6、枪、枪头放于超净台照射30min，枪喷DEPC水

B. 磁珠准备过程

1. 重悬磁珠

2. 标记实验所需的enpendoff管，样品包括目的样品，阴性对照与阳性对照

3. 吸取50ul 重悬后的磁珠悬液于每个enpendoff管

4. 每管加入500ul RIP Wash Buffer，涡旋震荡

5. 将enpendoff管置于磁力架上，并左右转动15°使磁珠吸附成一条直线，去上清，重复一次

6. 用100ul的RIP Wash Buffer重悬磁珠，加入约5ug相应抗体于每个样品中

7. 室温孵育30min

8. 将enpendoff管置于磁力架上，弃上清

9. 加入500ul RIP Wash Buffer，涡旋震荡后弃上清，重复一次

10. 加入500ul RIP Wash Buffer，涡旋震荡后置于冰上

三.  RNA结合蛋白免疫沉淀

A. 准备工作

1、冰盒

2、360°旋转仪

3、RIP Wash Buffer 、0.5M EDTA 、RNase Inhibitor 置于冰上

B. RNA结合蛋白免疫沉淀实验过程

1. 准备RIP Immunoprecipitation Buffer

2. 将前上步的enpendoff管放磁力架上，去上清，每管加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer

3. 迅速解冻第一步制备的细胞裂解液，14,000rpm，4℃离心10min。吸取100ul上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中，使得总体积为1ml

4. 4℃孵育3h至过夜

5. 短暂离心，将enpendoff管放在磁力架上，弃上清

6. 加入500ul RIP Wash Buffer，涡旋震荡后将enpendoff管放在磁力架上，弃上清，重复清洗6次

四、RNA纯化

A. 实验前准备

1. 枪、枪头、enpendoff管紫外照射30min，喷DEPC水以除RNA酶

2. Salt SolutionⅠ、Salt SolutionⅡ、RIP Wash Buffer、Proteinase K、10%SDS、 Precipitate Enhancer 置于冰上

3.RNase-free的乙醇、氯仿、异戊醇

4.DEPC水置于冰上

5. 离心机预冷

6. 冰盒

B. RNA纯化过程

1.准备Proteinase K Buffer。每个样品需150ul

2.用150ul Proteinase K Buffer重悬上述磁珠-抗体复合物

3. 55℃孵育30min

4. 孵育完之后，将enpendoff管置于磁力架上，将上清液吸入一新的enpendoff管中

5. 于每管上清液中加入250ulRIP Wash Buffer

6. 于每管加入400ul苯酚：氯仿：异戊醇，涡旋震荡15s，室温下14,000rpm离心10min

7. 小心的吸取350ul上层水相，吸入另一新的enpendoff管

8. 于每管加入400ul氯仿，涡旋震荡15s，室温下14,000rpm离心10min

9. 小心的吸取300ul上层水相，吸入另一新的enpendoff管

10. 每管加入50ul Salt SolutionⅠ，15ul Salt SolutionⅡ,5ul Precipitate Enhancer ，850ul 无水乙醇（无RNase），混合，-80℃保持1h至过夜

11. 14,000rpm，4℃离心30min，小心去上清

12. 用80%乙醇冲洗一次，14,000rpm，4℃离心15min，小心去上清，空气中晾干.

13. 10-20ul DEPC水溶解，-80℃保存，送测序

• 1 . miRNA的概述
  • 1.1. miRNA的生物发生
  • 1.2. miRNA的作用机制
  • 1.3. miRNA的研究展望
  • 1.4. miRNA与癌症
  • 1.5. miRNA在转化医学中的应用
• 2 . lncRNA的概述
  • 2.1. lncRNA的研究背景
  • 2.2. lncRNA的作用机制
  • 2.3. lncRNA的研究展望
  • 2.4. lncRNA与癌症
  • 2.5. lncRNA与临床疾病
• 3 . miRNA与lncRNA研究策略
  • 3.1. miRNA的一般研究策略
  • 3.2. AGO2在miRNA研究中的应用
  • 3.3. LncRNA的一般研究策略
  • 3.4. miRNA与lncRNA的生物信息学预测
• 4 . miRNA与lncRNA研究实验
  • 4.1. RNA 结合蛋白免疫沉淀技术（RIP）Model Figures
  • 4.2. RNA结合蛋白免疫沉淀技术（RIP）实验流程
  • 4.3. RNA结合蛋白免疫沉淀技术（RIP）实验常见问题
  • 4.4. RNA pull - down Model Figures
  • 4.5. RNA pull- down实验流程
  • 4.6. RNA pull- down实验常见问题
  • 4.7. 荧光素酶检测技术（Luciferase）Model Figures
  • 4.8. 荧光素酶检测技术（Luciferase）实验流程
  • 4.9. 荧光素酶检测技术（Luciferase）实验常见问题