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gRNA设计

gDNA设计

       

       CRISPR Cas9系统只需设计一个包含20个碱基对的RNA寡核苷酸,即可靶向任何基因组位点。gRNACRISPR Cas9系统的重要组成部分,在设计gRNA序列时需要考虑诸多因素。


1.crRNA、tracrRNA  and  gRNA

    在细菌和古细菌中,CRISPR RNAcrRNA)和反式激活CRISPR RNAtracrRNA)形成一个复合体,作为引导Cas9核酸酶降解外来遗传物质的引导装置。 我们将tracrRNAcrRNA结合成一个单一的合成的gRNA,这个单组分系统不仅简化了实验设计,而且还产生了相同或更高的导向效率(图1)。最常用的gRNA长约100个碱基对。 通过gRNA5'端的特异性的20个碱基对(蓝色区域),CRISPR Cas9系统可以靶向与该序列互补的任何基因组区域。

3.3.1gRNA设计①.png

Figure 1 :An example of the crRNA-tracrRNA complex and a gRNA


2 .gRNA设计原则

       CRISPR Cas9系统的靶向特异性由gRNA 5'末端的20个核苷酸序列决定。 对于化脓性链球菌CRISPRCas9系统,所需的靶序列必须紧接在5'-NGG PAM基序(间隔子相邻基序)之前,因此设计的序列为“20N+NGG3”。 gRNA通过互补碱基配对将Cas9核酸酶引导至靶序列,并且Cas9核酸酶使PAM序列上游〜3个核苷酸处双链DNA断裂(图2)

3.3.1gRNA设计②.png

Figure 2: For the S. pyogenes system, the target sequence must be immediately adjacent to a 5’-NGG PAM sequence. The gRNA will form complementary base paring with the opposite strand of the target sequence and mediate a double strand break ~3bp upstream of the PAM sequence through the Cas9 nuclease.

      

      由于一些启动子可以限制靶点选择和gRNA设计,因此选择合适的启动子驱动gRNA表达是必要的。 例如,依赖于RNA聚合酶III的U6启动子或T7启动子分别在RNA序列的5'端需要G或GG来启动转录。 因此,如果U6或T7启动子用于酿脓链球菌CRISPR系统中,那么靶序列分别限于下列形式:GN16-19NGG或GGN15-18NGG。 然而,通过将额外的G或GG添加到20个碱基对序列的5'末端(图3),可以绕过这个限制。

3.3.1gRNA设计③.png

Figure 3 – Sequence restrictions imposed by the use of U6 or T7 RNA polymerase III promoters for gRNA expression can be by passed as illustrated here.


在设计gRNA的20个碱基对的引导序列时,应考虑以下三点:

       1)GC含量:典型的范围在GC含量为40%-80%之间,其中GC含量较高的RNA更容易造成脱靶; 

       2)长度:长度可以调节,范围从17-24碱基对,较短的序列导致最小的脱靶效应;

       3)避免gRNA的潜在脱靶位点。

gRNA与靶位点之间的错配耐受性可导致CRISPR Cas9系统的脱靶效应,并且通常其发生取决于以下因素:

       ①.脱靶效应与gRNA的序列,其中一些gRNA对错配的耐受性比其它gRNA更小。

       ②.引入细胞的Cas9和gRNA之间的比例和比率也影响脱靶效应,小心地滴定Cas9和gRNA可以降低这些效应。

       ③. 通过非同源末端连接(NHEJ)途径进行基因沉默时,靶点需更接近于蛋白质编码区的N'端以产生最大的基因破坏。

       ④.基因组DNA的编码链和非编码链都可以被靶向,因为它们在产生突变方面同样有效。

       ⑤如果基因组编辑需要同源性定向修复(HDR),则目标位点的选择受到期望的插入位置的限制。

       

       在设计gRNA时,需要认真考虑上面列出的各种要求。精心设计的gRNA将会产生更高的编辑效率和最小化脱靶效应。


3.特殊的设计原则

       当使用成对的Cas9切口酶诱导的双链断裂时需要进一步考虑。注意以下几点很重要(图4):

       ⅰ.理想情况下,切割时需要产生5'悬垂链。

       ⅱ.两个gRNA之间的距离不超过20个碱基。

       ⅲ.两个gRNA需要在相反链上设计靶序列。 请注意,PAM序列需要在目标序列的上游。

       

       在设计了两种gRNA之后,它们可以以1:1的比例混合,并与Cas9 Nickase一起转染的细胞中。

3.3.1gRNA设计④.png

Figure 4 :When using paired Cas9 nickases additional considerations need to be given to the gRNA design. These include producing a 5’ overhang, the spacing between the two gRNAs, and the relative position of the two gRNA target sites.


4 .gRNA设计工具

       有许多工具可以帮助我们设计gRNA的过程。在这里,我们将重点介绍两个这样的工具:Chop Chop Harvard和CRISPR Design。


♫.Chop Chop Harvard

       将一段感兴趣基因序列或登录号码输入到Chop Harop Harvard(图5),软件分析序列并鉴定紧接着PAM序列(5'-NGG)的所有可能的20bp序列。然后根据预先设定的代码对GC进行评分,该代码查看GC含量和潜在脱靶位点,并将它们从最佳得分排列到最低得分。有关特定gRNA的更多信息,只需在gRNA序列上单击即可。这将打开显示该特定gRNA的潜在脱靶位点的页面,甚至提供可用于通过SURVEYOR测定来筛选这些脱靶位点潜在突变的引物序列。

3.3.1gRNA设计⑤.png

Figure 5 :The Chop Chop Harvard results page highlighting the ranking, exon position, and potential off target site counts.


♫.CRISPR Design

       使用CRISPR Design的主要优势在于能够提供所有潜在gRNA的脱靶目标的详细信息。 它使每一个gRNA序列都发生了突变,并提供了关于其脱靶位置和与设计的gRNA错配数目的详细报告。 当设计两个gRNAs用于配对的内切酶活性时,该软件也是优越的,因为它会自动发现两个彼此靠近的gRNA。

       然而,这个软件的主要缺点是它一次只能分析500个碱基对的序列。 因此,我们建议使用Chop Chop Harvard选择潜在的gRNA序列,然后推荐进一步的分析用CRISPR Design工具。


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