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Luciferase 荧光素酶实验

 Luciferase 荧光素酶实验

启动子荧光素酶活性检测

萤光素酶报告基因实验(luciferase Assay)是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段,其原理简述如下:(1)用靶启动子的特定片段替换报告基因质粒(如pGL3-basic)的启动子区。(2 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转。如果该转录因子能够激活靶启动子,则萤光素酶就会表达,且其表达量与转录因子的作用强度成正比。(3 加入特定的底物,萤光素酶与底物反应,产生萤光素,检测荧光的强度可以对萤光素酶的活性定量,进而判断该转录因子能否与靶启动子片段发生作用 (及其作用强度)。

启动子荧光素酶载体.png

Promoter活性Luciferase实验常用载体——pGL3

3’-UTR活性检测

由于miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用,可以将目的基因3’UTR区域构建至载体中报告基因luciferase的后面, 通过比较过表达或者干扰miRNA后,报告基因表达的改变(监测萤光素酶的活性变化)可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用;结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。

3'-UTR荧光素酶载体.png

miRNA靶基因Luciferase实验常用载体——psiCHECK2

 

 

3'-UTR荧光素酶原理.png

PCR扩增Luciferase点突变靶基因

 

启动子荧光素酶实验原理流程.png

 

 

在荧光素酶活性实验过程中我们设置一系列的质控标准以确保每一步实验的真实有效,如目的基因启动子片段扩增跑胶图、重组质粒PCR验证跑胶图、测序,最后结果分析。具体示例如下图所示(以启动子荧光素酶为例):


启动子荧光素酶-片段扩增.jpg


目的基因启动子片段的PCR扩增

 启动子荧光素酶重组质粒PCR验证.png


重组质粒PCR验证,证明目的基因片段插入到报告质粒载体上。

 

启动子荧光素酶-结果.jpg

启动子荧光素酶活性检测结果示例,本实验检测的是转录因子与目的基因启动子的关系,从上图结果我们可以看出转录因子对目的基因的启动子起作用促进基因的表达,而目的基因启动子片段突变后基因的表达就不受转录因子的影响。

 


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