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CRISPR-Cas9基因敲入

Cas9基因敲入(knock in)

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1基因敲入原理图

-、概要

1. 设计sgRNA-Cas9及修复DNA模版

2 .构建sgRNA-Cas9质粒及修复DNA模板质粒

3 .sgRNA-Cas9、修复DNA模版共转293T细胞

4. 嘌呤筛选,检测荧光

5 .PCR检测基因组,RFP蛋白是否敲入

 

1. 设计sgRNA及修复DNA模版

   针对人类AAVS1 AAVS1 Safe Harbor基因设计了sgRNA进行软件分析以确保sgRNA没有预测的脱靶结合位点。设计DNA修复模版,两侧同源臂,其两侧各有600bp的同源臂。



2. 构建sgRNA质粒及修复DNA模板质粒

    将选定的sgRNA设计与CMV启动子驱动的Cas9基因一起克隆到pCas-Guide中以制备pCas-Guide-AAVS1(图2

DNA修复模板插入含有RFP-嘌呤霉素的pAAVS1-RFP-DNR表达载体(图2)。

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 2 sgRNA-Cas9质粒及修复DNA模版质粒



3 .sgRNA-Cas9、修复DNA模版共转293T细胞

    用lipofectmine2000转染试剂将上述两种质粒转染至293T细胞。



4. 嘌呤筛选,检测荧光

     嘌呤筛选3-4

     3-4周后,> 95%的HEK293细胞表达RFP(图3)。

 

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3 荧光检测图片  A转染筛选后明场图片   B转染筛选后荧光图片 C未转染加嘌呤筛选细胞


5 .PCR检测基因组,RFP蛋白是否敲入

    为了证实在基因组DNA中敲入RFP,设计引物对,引物1靶向RFP上游的5'同源臂和靶向RFP-嘌呤霉素基因内的引物2

1.1kbPCR产物表明在AAVS1位点敲入成功; 没有PCR扩增指示敲入不成功(图4)。

    在对照细胞('WT细胞')中没有看到PCR扩增。

 

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