Cas9敲除基因(knock out)

【概要】

1.设计sgRNA

2.构建sgRNA-Cas9载体

3.构建sgRNA-Cas9稳转株

4 .筛细胞克隆并进行qPCR验证

5 .阳性克隆测序，选择敲除純合细胞株

6 .筛选细胞单克隆测序

【实验技术】

➤1.设计sgRNA

针对小鼠LIF基因座（Mus musculus，NM_008501）设计了三种sgRNA。 进行软件分析以确保sgRNA没有预测的脱靶结合位点。

➤2.构建sgRNA-Cas9载体

 然后将选择的sgRNA设计克隆到pLenti-U6-sgRNA-SFFV-Cas9-2A-Puro All-in-One lentivector中（图1）。

图1 sgRNA-Cas9载体图谱

➤3.构建sgRNA-Cas9稳转株

   利用慢病毒包装体系构建sgRNA-Cas9稳转株，进行嘌呤筛选

➤4. 筛细胞克隆并进行qPCR验证

    嘌呤霉素筛选后分离细胞克隆。 提取基因组DNA并进行验证测定目的基因座是否进行编辑

图2 qPCR检测基因组编辑情况

    在野生型（WT）测定中的单个条带表示没有发生编辑; 两个较小的条带（总和WT的长度）表示编辑已经发生。图2表明，克隆 3和6编辑; 克隆2没有编辑; 克隆1是不确定的。

➤5 .阳性克隆测序，选择突变细胞株

   通过Sanger测序进一步分析细胞集落3和6的PCR产物以确定敲除的性质（图3）。

 图3 细胞基因组测序结果

    对于细胞集落3，只检测到一个突变序列，表明这些细胞可能只是杂合敲除。 在菌落6中检测到两种不同的突变序列。

➤6. 筛选细胞选择单克隆純合突变细胞株

    将菌落6连续稀释到96孔板中进行单克隆选择。 从这些克隆（即6a，6b ..）中提取基因组DNA，进行PCR扩增，克隆和测序。

图4 细胞基因测序结果

    测序显示，在两个等位基因中只有克隆6a具有移码突变（图4）。 移码突变破坏了开放阅读框架，导致无意义介导的mRNA。

➤7、进一步测序，确定純合突变

    图5 细胞基因组测序结果

• 1 . CRISPR-Cas9基因沉默
• 2 . CRISPR-Cas9基因敲入
• 3 . dCas9定点调控表达
• 4 . dCas9定点调控表观遗传
• 5 . dCas9介导转录调控