转录因子Tox2通过调节染色质的可及性驱动T滤泡辅助细胞的发育

作者首先分析了几个数据集表明Bcl6在Tfh分化过程中直接驱动Tox2表达（补充数据）。为了弄清Tox2是否在Tfh细胞中选择性表达，作者分析Tox2基因座的表观遗传学特征，发现它在Tfh细胞中被活性染色质标记H3K4me3标记而没有被抑制性色氨酸标记H3K27me3标记，而在体外和非Tfh细胞或其他T细胞谱系中则相反（图1A）。小鼠的Tfh细胞进行ATAC-seq分析表明与原始CD4 + T细胞相比，Tfh中Tox2基因座染色质可及性增加（图1B）。为了确认Tox2在Tfh细胞中选择性表达，对CD4 + CD44lo，non-Tfh，pre-Tfh和Tfh细胞进行了分类并通过qRT-PCR检测，发现Tox2的mRNA水平在CXCR5hiBcl6-RFPhi Tfh细胞中高表达（图1C），并且与Cxcr5，Bcl6和Pdcd1紧密相关（图1C）。另外补充数据中qRT-PCR结果显示IL-6和IL-21在明显诱导Tox2表达，而IL-21阻断可增强Tox2表达，在Stat3或者Bcl6缺乏时Tox2 mRNA表达都降低。说明IL-6和IL-21诱导Tox2表达同时依赖于Stat3和Bcl6。

（1）Tox2的表达促进Tfh分化（图略）

已有研究显示Tox2可以促进人NK细胞中Tbx21的表达，为了验证Tox2在CD4 + T细胞中是否具有相似的功能，作者构建了Tox2过表达的CD4 + T细胞，然后在中性和Th1分化条件下对细胞进行分选和培养。显示Tox2过表达使得Bcl6以及其他与Tfh相关的基因（包括Cxcr5，Il6st和Tcf7 ）mRNA及蛋白质表达大量增加。然后，通过将Tox2转导的细胞或其对照细胞转移到受体小鼠中进行体内通过CFA中的鸡卵清蛋白（OVA）免疫进行免疫分析，表明Tox2转导的细胞中的Tfh细胞的频率显着增加，而且相应的Tfh分化分子CXCR5，PD-1和Bcl6的表达增强。

（2）Tox2调节Tfh相关基因的转录

为了深入了解Tox2调节Tfh分化的机制，作者进行了RNA-seq分析。与Th0条件相比，在Tfh中2,913个基因的表达变化超过1.5倍，Tox2过表达细胞在Th0和Tfh条件下，分别有1,605和1,311个基因的表达改变了1.5倍以上（图3A）。然后，作者选择在Tfh细胞中差异表达的已发表基因进行基因集富集分析（GSEA）。首先评估了IL-6信号在Tfh发育过程中的作用，并观察到Tox2-RV-GFP + CD4 + T细胞对Tfh细胞中促进的基因组显着富集（图3B），在Tfh细胞中受阻的基因在空对照细胞中更富集。通过不同的表达基因（DEG）和GSEA分析，Tox2促进了许多Tfh标志基因（Bcl6，Cxcr5，Pdcd1等）的表达，并抑制了许多在Tfh细胞中被抑制的基因（Gzmb，IL2ra等）的表达（图3C）。同时，Th1相关基因（Il12rb2和Tbx21）和Th17相关基因（Il17a，Il17f，Ahr和Rorc）在Th0和Tfh样条件下mRNA表达中也被Tox2抑制（图3C）。

 为了确定Tox2是否直接调节上面的基因，作者通过ChIP-seq检测了Tox2靶基因，确认了4,628个Tox2结合峰，其中分别有46％、24.6％和35.4％的内含子、启动子和远端基因间区域富集（图3D）。比较显示，在2908个Tox2结合基因中，有336个受Tox2转录调控，包括Bcl6，Cxcr5，Tcf7和Il2ra（图3E）。在Tfh标志基因（Bcl6，Cxcr5，Pdcd1和Batf）和炎性标志基因（Il2ra，Tbx21，Rorc，Il2和Il17a）中发现Tox2结合峰（图3F）。为了确认结果，作者使用表达Tox2：HA的细胞对Bcl6和Cxcr5基因座进行了ChIP-qPCR分析证明了Tox2结合（图3G）。此外，ATAC-seq发现Tox2结合位点与Tfh细胞中的可及区域相关（图3F），从而验证了Tox2在Tfh细胞中的功能。接下来，结合了三个数据集确定了共有59个直接受Tox2调控的基因，将这些基因与Bcl6靶标（74个基因）和Ascl2靶标（44个基因）进行比较发现Tox2、Bcl6和Ascl2仅共同激活了Slc9a9和Tcf7这两个基因，其中TCF-1（ Tcf7）被证明是Tfh细胞生成的关键调控因子（图3H）。Tox2和Bcl6可以抑制Th1相关的Ahr、Nek6、Socs2、Ncs1和Chd7基因表达，而Tox2和Ascl2可以抑制Th1相关的Tbx21、Il2ra和Ifitm3基因表达而Cxcr5表达上调（图3H），表明在Tfh发育过程中Tox2与Bcl6和Ascl2协同作用。

 （3）Tox2功能促进染色质重塑

由于Tox2包含与DNA结合并可能改变染色质构象的高迁移率族（HMG）盒，因此作者假设Tox2编程CD4 + T细胞中的染色质重塑以促进Tfh细胞发育。通过ATAC-seq分析发现在Tfh与原始CD4 + T细胞之间存在超过26,000个区域的差异（图4A）。在Th0条件下或在培养基中激活的被GFP病毒感染的T细胞，只有839个差异区。当Th0添加IL-6来形成类似Tfh的条件时，改变了2071个区域，其中Bcl6，Tcf7，Ror3和Il23r基因座更易获得，而Il7r和Socs2基因座则更少。当Tox2过表达时，在Th0和Tfh条件下可分别8,700和13,000多个区域（图4A）。因此，在Th0和Tfh条件下，阻断IFNg，IL-4和IL-2会降低整体染色质的可及性，而Tox2的表达会增加CD4 + T细胞中可及区域的数量。

数据显示3,546个元素在染色质可及性方面有所提高，包括Bcl6，Cxcr5和Pdcd1位点，在Tox2过表达后Tfh细胞中只有121个基因组位点关闭（图4B和4C），在Th0和Tfh条件下培养的T细胞中，Bcl6，Cxcr5，Pdcd1和Tcf7区域也更容易接近（图4D）。接下来，作者探索Tox2如何影响TF的活性，分析显示，当在激活的T细胞中阻断IFNg，IL-4和IL-2时，Stat1，Stat3，Stat4，Stat5和Stat6结合基序的富集减少（图4E），IL-6信号传导增加了AP-1家族和与Tfh或Th17相关的TF（例如Batf和Stat3）的活性（图4E）。同时，在Th0和类似Tfh的条件下，Tox2过表达后结合力下降，其中Bach2，Prdm1和Stat5负调控Tfh分化（图4E）。这些数据表明Tox2在Tfh分化过程中直接调节染色质的可及性。

为了确定Tox2在Tfh分化中的重要性，作者通过CRISPR / Cas9在保守的外显子3中删除了14个碱基对，产生移码突变和所有同工型的翻译提前终止，证实Tox2缺陷型CD4 + T细胞的内在缺陷会影响Tfh分化。同样的发现Tox2缺陷型OT-II细胞显示出Tfh分子CXCR5，PD-1，Bcl6，Ascl2，Bcl6，Cxcr5和Pdcd1的表达减少，但Il7r mRNA表达增加。考虑到Tox家族除Tox2之外还具有Tox，Tox3和Tox4成员，它们在Tfh细胞分化中是否具有任何冗余功能？首先检测了Tox，Tox3和Tox4的mRNA表达水平，发现Tox2缺陷OT-II中Tox和Tox3（几乎没有表达）表达有所增加但Tox4在这些细胞中的表达下降，这表明Tox在具有Tox2的Tfh细胞中可能具有功能冗余。此外，我们通过检测Tfh细胞Tox  mRNA的表达证实了Tox在Tfh细胞中的高表达，这通过流式细胞术实验得到了证实。

为了研究Tox在Tfh发育中的作用，在CD4 + T细胞中进行了Tox过表达，发现Tox在Th0和类似Tfh的培养条件下均能促进Bcl6，Ascl2，Cxcr5，Pdcd1，Il6ra，Il6st，Tcf7和Tox2 mRNA表达，表明Tox也可能促进Tfh的发育。然后，通过将Tox转导的OT-II细胞转移到Tcrbd /受体小鼠中，发现Tox的过表达在第7天显着增加了Tfh细胞的百分比。同时，Tcrbd /小鼠中的GC B细胞也明显增加。在mRNA水平上，Tox转导的OT-II细胞具有更高的Ascl2，Bcl6，Cxcr5和Pdcd1表达。这些数据表明Tox2和Tox都参与促进Tfh发育。