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Chip-seq实验流程

ChIP-Seq技术包括两部分：建库和测序，建库和测序的质量对于后续分析尤为关键，但是建库前ChIP实验的设计也同样重要。从实验的操作来讲ChIP主要分为两大类，一类是X-ChIP，一类是N-ChIP。其中N-ChIP不涉及甲醛交联，更适合那些和DNA有强相互作用的蛋白ChIP-seq实验，主要就是组蛋白；而X-ChIP采用甲醛交联就没有这个限制，广泛适用于转录因子, 组蛋白, 聚合酶等蛋白的结合片段测序。

ChIP主要包括以下几方面内容：

• ChIP样本预处理：使用甲醛处理细胞，使DNA-protein的相互结合作用被交联固定（下图-2）

• 获取核DNA：裂解细胞，得到全细胞的裂解液，提取核DNA

• DNA片段化：超声处理或者用微球菌核酸酶进行消化，将基因组DNA打断（下图-3）

• 超声破碎结果检测：取部分破碎产物解交联，凝胶电泳检测总DNA完整性和片段化情况

• 设置分组：严格的ChIP实验包括三组，实验组以及两个对照（input-DNA和IgG-control），分别为阳性对照和阴性对照

• 免疫沉淀：抗体免疫沉淀，实验组加入特异性抗体和beads进行孵育，control组加入非特异性抗体和beads进行孵育，形成磁珠-抗体-靶蛋白-DNA复合物（下图-4）

• 解交联：input可直接解交联，纯化得到断裂后的基因组DNA，实验组和control需洗脱得到抗体-目的蛋白-DNA复合物，去除非特异性结合的DNA片段，使用蛋白酶K/NaCl处理进行解交联，最后将DNA片段纯化回收（下图-5）

• 验证：通过qPCR对ChIP结果进行验证

• 高通量测序：准备好ChIP后的DNA样品用于ChIP-Seq建库，质检及测序（下图-6/7）

要做好ChIP-Seq主要需考虑几个问题如下：

• 抗体特异性和质量

• DNA测序深度的影响（数据量要求）

• 生物学重复

• 对照样本的设置

在ENCODE联盟的实验指南中也都有说明： ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia - PubMed

Chip-seq建库流程

ChIP Sequencing 文库构建流程：

1. 用qubit 对ChIP片段进行定量检测

2. 补齐片段末端，并在3’末端加A尾

3. 添加Adapter

4. 0.8X AMPure beads去掉多余的Adapter

5. 文库PCR扩增

6. 1XAMPure beads 去掉多余的primer

7. qPCR测定文库浓度

8. Agilent 2100测定文库片段大小

如何才能得到一个好的Chip结果？

ChIP-seq是一种结合免疫共沉淀和二代测序来研究组蛋白或转录因子与DNA之间相互作用的技术。在这类研究中，很多因素都会影响研究结果，因此要做足功课才能获得一个接近完美的研究结果。需要做哪4大准备工作？

1、样本准备

ChIP实验中不同的研究对象需要的样本量是不同的。因组蛋白的表达量相对较高，如果研究组蛋白与DNA的相互作用，需准备的细胞量为105-106；而转录因子的表达量相对较少，需要的细胞量就相对较高，需准备的细胞量为106-107。当样本是组织时，就需根据组织样本能提出的染色质量决定，与植物相比，一般动物组织需求量较少。

2、抗体选择

ChIP实验中需求的抗体至少是ChIP级，即我们在查询抗体时需有“ChIP-Grade”标识。一般常见的组蛋白H3K4me3、H3K9me3等都有对应的ChIP级商业化抗体，常用的抗体牌子有abcam、merck millipore等。对于没有ChIP级抗体的组蛋白或转录因子，可通过转标签蛋白进行，最经常使用的标签包括HA、Flag、GFP、c-myc等。

我们可通过两种方式验证抗体是否可以跨物种使用：

通过WB实验验证抗体有无特异性。若特异性较强，该抗体就可以跨物种使用。

通过比对目的蛋白在两个物种中序列的同源性。若同源性在80%以上，该抗体就可以跨物种使用。

3、生物学重复

ChIP-seq是否要设置生物学重复一直是大家比较关心的问题。由于ChIP实验操作难度较大、步骤繁琐、影响因素多， 所以ChIP-seq中生物学重复的一致性相对较差，很多人都不建议设置生物学重复。但近几年很多高分文章在进行ChIP-seq研究时都设置了大量的生物学重复。鉴于这两种情况，我们可以得出两个结论：ChIP-seq可以不设置生物学重复；如果设置生物学重复，要尽可能增加重复个数。

4、对照设置

做ChIP实验时经常要设置非特异抗体IgG为阴性对照，那么ChIP-seq需要用IgG富集的产物进行背景噪音的去除吗？No！一般不建议用IgG产物作为ChIP-seq的对照，原因如下：

大多数IgG抗体与转录因子或组蛋白抗体不是来源于同一动物的免疫前血清。IgG通常能富集到很少的DNA，导致后期建库过程中PCR循环数增加，不能达到作为对照去除背景噪音的目的。Input可以很好的避免上述问题，起到去除背景噪音的作用。此外通过IP与input比较可以验证染色质断裂效果。