转录因子相关研究案例（四）

日期：2017-09-21 标签：Noncoding,RNA

Noncoding RNA Gas5 Is a Growth Arrest and StarvationAssociated Repressor of the Glucocorticoid Receptor

一、调控通路

Gas5是一种在细胞缺乏营养物质或生长因子导致生长停滞时高表达的非编码RNA，通过抑制糖皮质激素介导的几个应答基因的表达促进细胞凋亡。Gas5作为糖皮质激素响应原件诱饵与响应原件（GRE）竞争结合到糖皮质激素受体（GR）的DNA结合位点，调控基因的表达。

二、实验流程

作者首先通过RIP实验验证了在Dex处理后非编码RNA Gas5与GR结合增加，然后又通过荧光素酶实验验证了Gas5通过与GR互作抑制下游靶标基因的表达。作者另外通过RNA免疫荧光原位杂交的核质分离来说明细胞受Dex刺激后Gas5和GR从细胞质中转移进入细胞核起作用，然后通过chip实验表明dex刺激使细胞GR结合到靶标基因启动子降低抑制基因的表达。随后作者分别对Gas5进行过表达和敲低后用dex处理细胞，检测与GR应答相关基因的表达，表明dex刺激Gas与GR互作抑制靶标基因表达。作者最后通过Gas5不同片段以及预测的与GR结合位点突变的荧光素酶实验验证Gas5与GR的结合位点。

三、核心FIGURE

Figure1说明的是Gas5与GR结合互作抑制其对响应原件基因的转录激活活性。

A-B、RIP实验，用GR抗体钓取Dex处理和未处理细胞中与GR结合的RNA，然后进行q-pcr检测，表明在Dex处理后，细胞的Gas5与GR结合增加。

C、荧光素酶实验，将Gas5表达质粒、GR表达质粒和连接GRE的荧光素酶报告质粒共转染细胞，然后检测荧光素酶活性，表明Gas5抑制GR的转录活性但不抑制包含GAL4的嵌合体的转录活性。

Figure2说明的是Gas5在细胞质和细胞核中都存在，在Dex处理后Gas5转移进入细胞核参与GR应答。

A、 RNA FISH，用Gas5探针检测细胞中的Gas5的定位，表明细胞核和细胞质中均含有Gas5，下图使用RNase处理作为阴性对照。

B、 核质分离，用Dex处理细胞后进行核质分离，然后分别检测细胞质和细胞核的GR和Gas5，表明Dex处理使细胞质中的Gas5和GR转移进入细胞核。

Figure3说明的是Gas5的过表达抑制GR与响应原件基因互作抑制基因mRNA的表达。

A、 Gas5过量表达检测。

B、 Gas5过量表达后检测clAP2 Mrna的表达，表明Gas5过量表达后Dex的处理使clAP2 mRNA的表达降低。

C、 ChIP实验，用GR抗体钓取Dex处理和未处理的Gas5过量表达细胞中与GR结合的DNA片段，然后进行q-pcr检测跑胶，表明Dex处理使GR结合到clAP2启动子上减少。

Figure4说明的是Gas5抑制GR诱导的糖皮质激素应答基因mRNA的表达。

A、 Gas5表达质粒转染细胞后，用Dex处理，然后检测细胞GR诱导的基因mRNA的表达，表明Gas5表达使mRNA表达降低。

B、 ChIP实验，Gas5表达质粒转染细胞后，用Dex处理，然后用GR抗体钓取细胞中与GR/GRE结合的DNA片段，进行q-pcr检测，表明Gas5表达使GR/GRE与基因启动子结合降低。

                                  本公司可提供的技术服务

本公司可进行以上类似实验的实验设计及整体实验外包项目，包括q-pcr、核质分离、Luciferase assay、FISH、RIP、ChIP、WB、慢病毒稳转株的建立（过表达/敲低），其中核质分离、Luciferase assay 、FISH、RIP、ChIP为本公司主营项目。

一、Luciferase assay：荧光素酶实验检测转录因子与基因启动子之间的关系

将Gas5表达质粒、GR表达质粒和连接GRE基因的荧光素酶报告质粒共转染细胞，并用Dex处理细胞，然后检测细胞的荧光素酶活性，表明Gas5抑制GR促进基因转录的活性但不抑制包含GAL4的GR嵌合体的活性。

二、RNA-FISH：RNA的免疫荧光原位杂交技术，对细胞中RNA进行定位的重要方法。

用Gas5的RNA探针检测细胞内的Gas5，绿色荧光为Gas5的位置，蓝色为细胞核位置，作者用Rnase处理细胞作为阴性对照，表明Gas5存在于细胞质和细胞核中。我公司在实验体系中设置阴阳性内参。

三、核质分离：对细胞质和细胞核进行分类后，检测其中目的RNA或蛋白含量，是RNA和蛋白定位的重要手段之一。

用Dex处理细胞后进行核质分离，然后分别检测其中的Gas5和GR，表明Dex处理使细胞质中的Gas5和GR转移进入细胞核。Α-tubulin是细胞质的标志物，Oct1是细胞核的标志物。

四、RIP：RNA免疫共沉淀技术，是研究RNA与蛋白互作的重要手段。

用GR抗体钓取Dex处理和未处理细胞中与GR结合的RNA，然后进行q-pcr检测，表明在Dex处理后，细胞的Gas5与GR结合增加。我公司在实验体系中设置阳性及阴性对照，进一步排除系统误差。

五、ChIP：染色质免疫共沉淀技术，主要研究转录因子与靶标基因启动子之间的关系

用GR抗体钓取Dex处理和未处理的Gas5过量表达细胞中与GR结合的DNA片段，然后进行q-pcr检测跑胶，表明Dex处理使GR结合到clAP2启动子上减少。我公司在实验体系中设置阳性及阴性对照，进一步排除系统误差。

参考文献：Tomoshige Kino,Darrell E. Hurt,Takamasa Ichijo,et al. Noncoding RNA Gas5 Is a Growth Arrest and StarvationAssociated Repressor of the Glucocorticoid Receptor[J]. Sci Signal,2010, 3(107): ra8