Glucocorticoids mediate induction of microRNA-708 to suppress ovarian cancer metastasis through targeting Rap1B

日期：2017-09-13 标签：糖皮质激素间接诱导microRNA-708以RaplB为靶标抑制卵巢癌的转移

mRNA翻译调控研究案例（二）

一、调控通路

MicroRNA-708在卵巢癌细胞中表达量很低，当细胞受到糖皮质激素（GC）的刺激后，GC诱导GRα结合到miR-708的启动子区促进miR-708的表达，随后miR-708与Rap-1B mRNA的3’-UTR区结合抑制mRNA翻译表达，Rap-1B是肿瘤细胞转移的重要标志蛋白，Rap-1B表达受到抑制后会抑制细胞的转移。

二、实验流程

作者首先通过microRNA的表达微阵列和用q-pcr检测microRNA708的表达筛选出在转移性卵巢癌细胞中异常低表达的miR-708，后续研究就是围绕miR-708进行。对miR-708的研究作者分别进行功能和机制的研究：（1）功能实验：将miR-708和miR-708+anti转染细胞后检测细胞的转移和侵袭以及小鼠体内实验说明miR-708能抑制卵巢癌细胞的转移。（2）机制实验核心包括三个部分的内容，一是miR-708的表达调控：作者用DEX处理细胞后检测miR-708和Odz2 RNA的表达说明miR-708和Odz2共转录形成；然后通过ChIP实验说明糖皮质激素诱导GRα结合到MIR708基因启动子上促进miR-708的表达。二是通过荧光素酶实验验证MiR-708与Rap1B Mrna的3’-UTR互作抑制Rap1B的表达。

三、核心FIGURE

Figure1说明的是糖皮质激素信号诱导GR与miR-708和ODZ4基因启动子结合促进基因的转录。

A、 用DEX处理细胞后检测ODZ4和miR-708的表达，表明DEX处理使ODZ4和miR-708的表达都升高。

B、 对GRα敲低后检测ODZ2和miR-708的表达，表明ODZ2和miR-708的表达受GRα的调控。

C、 分别用DEX和CHX处理细胞后检测ODZ2和miR-708的表达，表明DEX使ODZ2和miR-708的表达上升。

D、 ODZ2和miR-708的基因组上的位置示意图，ODZ2和miR-708共转录形成。

E-F、ChIP实验，用DEX处理细胞后用H3和GR抗体获取与蛋白结合的DNA片段然后进行q-pcr检测，表明DEX促进GR与ODZ2启动子结合。

Figure2说明的是miR-708以Rqp1B mRNA的3’-UTR为靶标抑制蛋白的表达，从而抑制肿瘤细胞的转移和侵袭。

A、 维恩图，预测的与Rqp1B相关的microRNA。

B-C、用miR-708、miR-708+anti转染细胞后，检测Rqp1B mRNA和蛋白的表达，表明miR-708抑制Rqp1B的表达。

D、 荧光素酶实验，将Rqp1B mRNA 3’-URT序列连接到荧光素酶报告质粒上与miR-708共转染细胞后检测荧光素酶活性，表明miR-708通过与Rqp1B mRNA 3’-URT互作抑制蛋白的表达。

E、 分别对Rqp1B和Rqp1A敲低后检测细胞的转移和侵袭，表明Rqp1敲低降低细胞的转移和侵袭。

F、 用DEX处理细胞后检测Rqp1B、pGRα和GRα的表达，表明DEX使Rqp1B表达降低而使pGRα升高。

Figure3说明的是miR-708抑制细胞粘附因子的形成，而Rqp1B促进细胞粘附因子的形成。

A、 蛋白-FISH，分别将MiR-708与Rqp1B敲低质粒共转染细胞后与FN粘连然后检测细胞中的Paxillin和b-actin，表明miR-708和Rqp1B敲低使黏附因子形成降低。

B、 分别将MiR-708与Rqp1B敲低质粒共转染细胞后检测磷酸化的桩蛋白和焦粘附激酶，表明miR-708和Rqp1B敲低使磷酸化的桩蛋白和焦粘附激酶降低。

C、 检测细胞的粘附性。

D、 蛋白-FISH，分别将miR-708与HA-Rqp1B重组表达质粒转染细胞后检测Paxillin和b-actin，表明miR-708使黏附因子形成降低，Rqp1B表达使粘附因子形成升高。

E-G、细胞粘附因子形成统计。

本公司可提供的技术服务

本公司可进行以上类似实验的实验设计及整体实验外包项目，包括Q-PCR、Western Blot、ChIP、Luciferase检测、慢病毒稳转株的建立（敲低）、FISH，其中的Luciferase检测、CHIP和FISH为本公司主营项目。

一、CHIP技术：主要研究蛋白与基因之间的关系。

用DEX处理细胞后用H3和GR蛋白抗体获取细胞中与相应蛋白结合的DNA片段，然后进行q-pcr检测，表明DEX处理后细胞的GR与MIR708启动子结合上升。我公司在实验体系中设置阳性及阴性对照，进一步排除系统误差。

二、Luciferase检测：验证microRNA与靶标3’-UTR的互作。

分别将Rap1B Mrna的3’-UTR序列和其突变序列连接到荧光素酶报告质粒上，与miR-708和miR-708+anti708共转染细胞后检测细胞的荧光素酶活性，表明miR-708与Rap1B 3’-UTR互作抑制荧光素酶活性。

三、FISH：免疫荧光原位杂交技术，对蛋白、RNA、DNA进行细胞内的定位、定量。

分别将MiR-708与Rqp1B敲低质粒共转染细胞后与FN粘连然后检测细胞中的Paxillin和b-actin，表明miR-708和Rqp1B敲低使黏附因子形成。

参考文献：Kai-Ti Lin,Yu-Ming Yeh,Chi-Mu Chuang,et al. Glucocorticoids mediate induction of microRNA-708 to suppress ovarian cancer metastasis through targeting Rap1B[J].NATURE COMMUNICATIONS,2014,6:5917