RAP实验步骤

注：实验全程环境为 Nuclease-free 环境，全过程须使用无 RNase 污染的实验用具和试剂，操作过程中也要防止 RNase 污染

A 细胞裂解与染色体超声断裂

1.向Cell lysis buffer（SCAP-1）中加入蛋白酶抑制剂和RNA 酶抑制剂，每mL加入12uL PMSF（SCAP-9）和10uL蛋白酶抑制剂（SCAP-8）和5uL RNase inhibitor（SCAP-10）；

2.在交联的细胞沉淀中加入 1mL 含有蛋白酶抑制剂和RNA 酶抑制剂的 Lysis Buffer，吹打重悬并涡旋震荡 15s，然后在4℃旋转裂解1-2h；

B 探针-RNA免疫沉淀

1.取上述步骤所得上清液45µL至1.5mL离心管，储存于-20℃，此为Input。

2.取上述步骤所得上清液450µL至1.5mL或2mL的离心管中，加入2倍体积（即0.9mL）的Hybridization buffer（SCAP-2），并加入5uL RNase inhibitor（SCAP-10）,并按每个反应加入100pmol（约500~600ng）探针的量加入标记的DNA探针，于37℃旋转孵4h。

3. 在探针与裂解液孵育将近4h时进行磁珠预处理，即每个IP组取50uL链霉亲和素磁珠（SCAP-7）只离心管中，于磁力架上静置直到磁珠完全吸附到管壁上，吸除上清，再用500uL Lysis Buffer（SCAP-1）洗磁珠2次，吸除上清备用。

4.探针与裂解液孵育4h后，转移至处理好的磁珠管中，37℃旋转孵30min。

5.轻微离心后置于磁力架上待溶液澄清，弃掉上清液。

6.加入1mL Wash Buffer（SCAP-3）在37℃旋转洗5min，轻微离心后置于磁力架上待溶液澄清弃掉上清液。

7.重复清洗5次。

8.清洗好的磁珠每个IP组取1/10-1/5磁珠于新EP管中用于提取RNA，剩下的用于提取蛋白。Input组取等量（1/10-1/5）提取RNA。

C RNA、蛋白的洗脱

RNA洗脱（1/10-1/5）：

1.向磁珠中加入50uL PK buffer(SCAP-4)和5uL Proteinase K(SCAP-6)，于65℃孵育45min，然后95℃孵育5min使DNA探针与目的RNA分开，迅速置于冰上，加入500uL的Trizol溶液涡旋振荡10s，室温静置10min；input组直接加入500uL Trizol溶液提取RNA。

2.再加入100 μL 氯仿，涡旋振荡10s，在4℃，12000rpm离心15min后小心吸取上层水相至新的离心管中；

3.加入2.5倍体积无水乙醇混匀（可选择加入1-2uL糖原帮助沉淀，糖原可使用碧云天的）后置于-80℃沉淀过夜。

4.第二天取出在4℃，12000rpm离心15min后小心去除上清，然后用75%乙醇清洗沉淀3次，最后一次尽量完全去除上清，开盖晾干3min左右，用15uLRNase-free H₂O溶解。

蛋白的洗脱（剩余的磁珠和input）：

1.向磁珠中加入40uL elution buffer，100ug/mL RNase A和0.1U/uL RNase H，于37℃孵育30min;

注：这里的RNase A和RNase H是终浓度。

2.后加入10uL 5x蛋白Loading buffer，100℃煮10min后离心取上清于新的EP管中即为蛋白产物。蛋白产物可用于银染，质谱或WB检测。

RAP试剂盒