eRNA相关文献解读（一）

日期：2018-01-10 标签：eRNA相关文献解读（一）

图1 LED对P53通路基因表达的调控机制

作者首先用Nutlin-3a处理细胞后筛选出包括LED在内的高表达的前三个LncRNA，然后通过P53-ChIP实验表明P53调控这3个LncRNA的表达，随后作者对这3个LncRNA进行干扰表达表明只有LED对P53调控的基因表达有影响，说明LED是P53调控途径中所必需的。

另外，LED干扰会明显降低细胞循环相关的P21的水平。随后，作者通过LED的细胞定位、ChIRP表明LED在P21增强子区域富集，然后通过荧光素酶实验说明LED与P53共同调控P21eRNA的转录。

通过ChIP实验表明LED通过影响P21e上的组蛋白H3K9的乙酰化水平来影响P21eRNA的转录。通过染色体环构象捕获技术（circular chromosome conformation capture(4C)）表明LED通过使P21的增强子和启动子形成染色体环促进P21基因的表达。

作者在最后通过LED启动子CpG岛的甲基化检测说明癌细胞的LED的表达受其基因启动子的超甲基化水平抑制。

LED是P53调控途径中所必需的

作者首先通过RNA-seq分析Nutlin-3a处理后的细胞RNA的表达，从高表达的LncRNA中筛选出最高的3个LncRNA（下图a和b），然后作者通过干扰P53的表达后检测这3个的表达是否受P53的调控表明这3个LncRNA均受P53的调控；

另外通过P53-ChIP实验表明P53与这三个基因结合。随后对这3个lncRNA进行干扰表达，检测下游P53靶标表达表明只有LED干扰（下图c）后，P53通路受影响细胞循环相关的P21表达明显降低（下图d和e），说明LED是P53调控通路所必需的并且是保持P53依赖的细胞循环相关的P21高表达所必需的。

LED是保持细胞循环相关的P21基因高表达所必需的元件，那么，它是如何来保持P21基因的高表达的呢？我们继续往下看。

LED通过影响P21增强子区域组蛋白H3K9乙酰化调控P21eRNA的转录

作者首先通过核质分离检测细胞核和细胞质中的LED表明LED有部分位于细胞核中，于是作者再通过用LED的反向互补序列作为探针进行ChIRP检测LED与染色体的互作关系，表明LED在一些基因的强增强子区域富集。

为了检测LED对这些增强子的潜在功能，作者选择了包括P21在内的部分增强子进行研究，通过定量RT-PCR检测了一组选定的用于eRNA产生的LED相关增强子，在用和不用nutlin-3a处理的MCF-7细胞分析证实了在所有测试的LED相关增强子上eRNA的nutlin-3a依赖性转录诱导（下图a）。

这种nutlin-3a对eRNA的诱导是特异性的，因为对照的LED-未结合的FOXC1增强子（FOXC1e）RNA的丰度保持不受影响。RNA干扰介导的LED敲低降低了这些eRNA的活化水平（下图b），表明LED直接调节eRNA产生。

为了评估p21e的增强潜力，作者将1.2kb的片段克隆到pGL3启动子荧光素酶报道基因载体中，如预期的那样，p21e激活萤光素酶基因（下图a）。而分别对LED和P53敲低后的荧光素酶实验证明了LED或p53敲低降低了有义和反义p21e萤光素酶报告基因的增强活性（下图b）。

为了进一步描述LED调节增强子的作用模式，作者推测LED通过增强子域的表观遗传修饰来控制增强子活性。为了研究这种可能性，作者通过ChIP实验检测了LED是否影响活性增强子组蛋白（例如H3K27ac和H3K9ac）的修饰，ChIP分析揭示，在LED敲低时，在p21增强子结构域处H3K9ac（而非H3K27ac）的水平降低（下图c）。

在H3K9ac减少的同时，位于p21转录起始位点上游的远端和近端增强子处的p53结合亲和力较低。这些结果表明，LED可能通过影响增强子域或其附近的TF的结合和H3K9ac在特定增强子基因座上的沉积来影响eRNA的产生。

P21eRNA通过使P21基因启动子和增强子形成染色体环促进P21表达

通过使用Northern印迹（下图a）和RNAPII ChIP实验（下图b），作者进一步支持在p21e基因座处存在反义eRNA并且受nutlin-3a和LED调节。通过使用循环染色体构象捕获（4C）实验来检测p21e是否可以与远距离启动子相互作用。表明p21eRNA在p21启动子和增强子形成染色体环的功能域内起作用（下图c）。

P21eRNA通过使P21基因启动子和增强子形成染色体环促进P21表达

基因表达比较分析表明LED被p53激活，而且其功能与p53的转录应答密切相关，因此作者检测LED是否在癌症中失活。由于CpG岛经常发生超甲基化和沉默，因此作者检测LED启动子甲基化是否导致癌症中LED表达降低。

首先检测了135个癌细胞系中LED CpG岛的甲基化状态，发现所有测试细胞系中有44％（59/135）有LED启动子甲基化。随后在几种癌细胞系上通过启动子相关的高甲基化对LED的转录沉默表明LED表达与其甲基化状态之间存在显着的反相关性（下图a）。

与未甲基化的细胞系相比，LED的甲基化依赖性失活可能延迟或减少对p21 mRNA转录的诱导。最后，作者使用甲基化特异性PCR检测各种肿瘤类型的LED启动子甲基化水平，最显着的是急性淋巴细胞性白血病中达到了所有样品的22％（下图b）。

文献原文：NicolasLéveillé,CarlosA. Melo,Koos Rooijers,et al. Genome-wide profiling of p53-regulated enhancer RNAsuncovers a subset of enhancers controlled by a lncRNA.NAT COM,2015,10.1038/ncomms7520

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