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eRNA相关文献解读(一)

日期:2018-01-10 标签:eRNA相关文献解读(一)

文献讲述的是P53的特异激活剂Nutlin-3a诱导LncRNA linc00086(下称LED)基因表达后富集在其下游靶标基因的增强子区域,其中靶标之一为P21的增强子,与P53结合互作调控P21e上组蛋白H3K9的乙酰化并促进P21eRNA的转录。P21eRNA促进P21的增强子和启动子形成染色体环促进P21基因的表达。而当LED基因启动子序列超甲基化时,LED基因转录受到抑制。


图1 LED对P53通路基因表达的调控机制

 

作者首先用Nutlin-3a处理细胞后筛选出包括LED在内的高表达的前三个LncRNA,然后通过P53-ChIP实验表明P53调控这3个LncRNA的表达,随后作者对这3个LncRNA进行干扰表达表明只有LED对P53调控的基因表达有影响,说明LED是P53调控途径中所必需的。


另外,LED干扰会明显降低细胞循环相关的P21的水平。随后,作者通过LED的细胞定位ChIRP表明LED在P21增强子区域富集,然后通过荧光素酶实验说明LED与P53共同调控P21eRNA的转录。


通过ChIP实验表明LED通过影响P21e上的组蛋白H3K9的乙酰化水平来影响P21eRNA的转录。通过染色体环构象捕获技术(circular chromosome conformation capture(4C))表明LED通过使P21的增强子和启动子形成染色体环促进P21基因的表达。


作者在最后通过LED启动子CpG岛的甲基化检测说明癌细胞的LED的表达受其基因启动子的超甲基化水平抑制。


LED是P53调控途径中所必需的

作者首先通过RNA-seq分析Nutlin-3a处理后的细胞RNA的表达,从高表达的LncRNA中筛选出最高的3个LncRNA(下图a和b),然后作者通过干扰P53的表达后检测这3个的表达是否受P53的调控表明这3个LncRNA均受P53的调控;


另外通过P53-ChIP实验表明P53与这三个基因结合。随后对这3个lncRNA进行干扰表达,检测下游P53靶标表达表明只有LED干扰(下图c)后,P53通路受影响细胞循环相关的P21表达明显降低(下图d和e),说明LED是P53调控通路所必需的并且是保持P53依赖的细胞循环相关的P21高表达所必需的

LED是保持细胞循环相关的P21基因高表达所必需的元件,那么,它是如何来保持P21基因的高表达的呢?我们继续往下看。


LED通过影响P21增强子区域组蛋白H3K9乙酰化调控P21eRNA的转录

作者首先通过核质分离检测细胞核和细胞质中的LED表明LED有部分位于细胞核中,于是作者再通过用LED的反向互补序列作为探针进行ChIRP检测LED与染色体的互作关系,表明LED在一些基因的强增强子区域富集。


为了检测LED对这些增强子的潜在功能,作者选择了包括P21在内的部分增强子进行研究,通过定量RT-PCR检测了一组选定的用于eRNA产生的LED相关增强子,在用和不用nutlin-3a处理的MCF-7细胞分析证实了在所有测试的LED相关增强子上eRNA的nutlin-3a依赖性转录诱导(下图a)


这种nutlin-3a对eRNA的诱导是特异性的,因为对照的LED-未结合的FOXC1增强子(FOXC1e)RNA的丰度保持不受影响。RNA干扰介导的LED敲低降低了这些eRNA的活化水平(下图b),表明LED直接调节eRNA产生。

为了评估p21e的增强潜力,作者将1.2kb的片段克隆到pGL3启动子荧光素酶报道基因载体中,如预期的那样,p21e激活萤光素酶基因(下图a)。而分别对LED和P53敲低后的荧光素酶实验证明了LED或p53敲低降低了有义和反义p21e萤光素酶报告基因的增强活性(下图b)。


为了进一步描述LED调节增强子的作用模式,作者推测LED通过增强子域的表观遗传修饰来控制增强子活性。为了研究这种可能性,作者通过ChIP实验检测了LED是否影响活性增强子组蛋白(例如H3K27ac和H3K9ac)的修饰,ChIP分析揭示,在LED敲低时,在p21增强子结构域处H3K9ac(而非H3K27ac)的水平降低(下图c)


在H3K9ac减少的同时,位于p21转录起始位点上游的远端和近端增强子处的p53结合亲和力较低。这些结果表明,LED可能通过影响增强子域或其附近的TF的结合和H3K9ac在特定增强子基因座上的沉积来影响eRNA的产生。

P21eRNA通过使P21基因启动子和增强子形成染色体环促进P21表达

通过使用Northern印迹(下图a)和RNAPII ChIP实验(下图b),作者进一步支持在p21e基因座处存在反义eRNA并且受nutlin-3a和LED调节。通过使用循环染色体构象捕获(4C)实验来检测p21e是否可以与远距离启动子相互作用。表明p21eRNA在p21启动子和增强子形成染色体环的功能域内起作用(下图c)。


P21eRNA通过使P21基因启动子和增强子形成染色体环促进P21表达

基因表达比较分析表明LED被p53激活,而且其功能与p53的转录应答密切相关,因此作者检测LED是否在癌症中失活。由于CpG岛经常发生超甲基化和沉默,因此作者检测LED启动子甲基化是否导致癌症中LED表达降低。


首先检测了135个癌细胞系中LED CpG岛的甲基化状态,发现所有测试细胞系中有44%(59/135)有LED启动子甲基化。随后在几种癌细胞系上通过启动子相关的高甲基化对LED的转录沉默表明LED表达与其甲基化状态之间存在显着的反相关性(下图a)


与未甲基化的细胞系相比,LED的甲基化依赖性失活可能延迟或减少对p21 mRNA转录的诱导。最后,作者使用甲基化特异性PCR检测各种肿瘤类型的LED启动子甲基化水平,最显着的是急性淋巴细胞性白血病中达到了所有样品的22%(下图b)


文献原文:NicolasLéveillé,CarlosA. Melo,Koos Rooijers,et al. Genome-wide profiling of p53-regulated enhancer RNAsuncovers a subset of enhancers controlled by a lncRNA.NAT COM,2015,10.1038/ncomms7520



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