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外泌体成分与提取方法

日期:2017-12-15 标签:外泌体成分与提取方法

图片来源:网络

什么是外泌体?外泌体是包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm),目前被视为特异性分泌的膜泡,参与细胞间通讯。本篇文章主要通过对外泌体组成成分外泌体的分离方法进行介绍,使大家对外泌体有更清晰的了解。

外泌体的组成成分

外泌体主要有3大组成部分-蛋白质、核酸、脂质。众所周知,外泌体的脂质来源于细胞膜,属于磷脂双分子层结构,与细胞膜结构差异不大,故重点介绍外泌体中的蛋白与核酸。

外泌体中的蛋白可分为两大类,膜蛋白与膜内蛋白


膜蛋白

膜蛋白主要分两类,一类是几乎所有外泌体均含有的蛋白,这类蛋白可作为外泌体区别于其他囊泡(EVs)的标志物如(CD9CD63CD81CD326)。

另一类是特异性膜蛋白,特定细胞分泌的外泌体上特有的。如A33(结肠上皮细胞来源)、MHC-Ⅱ、CD86(抗原提呈细胞来源-T细胞、乳凝集素(不成熟的树突状细胞)这些膜蛋白主要用于分离外泌体或分离来源于特定细胞的外泌体。


膜内蛋白

膜内蛋白主要包括热休克蛋白家族((HSP60, HSP70, HSPA5, CCT2 HSP90)、代谢类的酶(GAPDH,烯醇化酶 1, 醛缩酶 1, PKM2, PGK1)、核糖体蛋白(RPS3)、信号转导因子(黑色素瘤分化相关因子, ARF1, CDC42, )粘附因子(MFGE8、整合素)、细胞骨架蛋白以及泛素。




核酸

 外泌体内的核酸包括DNARNA。在靶细胞内起作用的主要是RNA外泌体内的RNA主要包括mRNAmicroRNAncRNA,其中microRNA属于功能性RNA,他可以调节细胞内RNA和蛋白的水平,从而影响细胞的形态和功能。因此,microRNA是外泌体中研究最广泛最深入的RNA,且这些外泌体中的RNA往往与疾病的发生与发展有关。下表中介绍了许多与疾病有关的外泌体lncRNAmicroRNA


外泌体分离方法

无论是正常细胞还是癌细胞都会分泌外泌体。外泌体分布相当广泛,主要分布在血液、尿液、汗液、唾液、脑脊液、乳汁等体液系统中,我们要研究外泌体,首先要将外泌体从这些体液系统中提取出来


  • 超速离心法

低转速离心,去除细胞或其他大颗粒杂质,然后超速离心沉降外泌体。


  • 外泌体沉降法

即通过PEG或其他亲水试剂,将外泌体浓缩,低速离心后收集外泌体,市面上出售的外泌体提取试剂盒均采用此种方法。


  • 过滤法

一开始通过大孔径滤膜滤掉细胞,再通过小孔径滤膜滤掉蛋白等杂质,最后通过0.1um的孔过滤,得到外泌体


  • 免疫磁珠法

带有外泌体特异抗体的磁珠(如CD9,CD63CD81CD326)与样本孵育,用磁铁或离心等方法将外泌体分离出来


  • 综合法

上述几种方法,方法一、二、三、提取的纯度不够,方法四、提取的量不够,我们可以将这两组方法综合起来,先用方法一、方法二、方法三粗略提取外泌体,再用方法四提纯外泌体。


外泌体提取后,我们要检测我们提到的是否是外泌体,加测方法主要有流式检测、WB检测(检测指标有CD9,CD63CD81CD326)、电镜观察。


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