ChIP实验常见问题

日期：2014-12-24 标签：ChIP实验常见问题

1：非特异性抗体对照背景高

可能原因：

（1）非特异性结合 Protein A 或G beads

（2）ChIP 缓冲液污染了

（3）有些Protein A or G beads 产生高背景

解决办法：

（1）将标本和beads混合孵育1hr后去除，然后再加入抗体进行反应（包括预纯化标本步骤）

（2）重新配制新的缓冲液

（3）有些Protein A/G beads 产生高背景.尽量使用在非特异性对照中背景很低的Protein A/G beads

2：背景高、电泳结果难以分辨大小

可能原因：DNA片段太大

解决办法：对不同类型的细胞，DNA 片段化过程要进行优化。破碎后的DNA片段不应该大于1.5 kbp. 如果使用酶消化染色质的话，应该可以看到单个核小体的存在 (175 bp)

3：信号弱

可能原因及解决办法：

（1）染色质的片段太小了。 染色质超生破碎的大小不能小于500bp。太小的片段会使的核小体被误认为核小体间的DNA而被消化掉。如果做N-ChIP，酶切反应足够来片段化染色质了。

（2）如做的是X-ChIP,有可能是细胞被交联太久。 用甲醛交联10-15分钟然后用PBS洗涤。细胞可能需要用甘氨酸处理以去除多余的甲醛.过度的交联会封闭抗原结合表位从而降低抗体的结合。

（3）染色质用量不足。推荐每次实验染色质的用量是25 μg

（4）免疫沉淀用抗体量不足。推荐使用3-5 μg抗体进行初次实验，如果没有信号则可以增加到10μg的用量。

（5）特异性的抗体结合被清除了。洗液中的NaCl 浓度不能高于500 mM ，因为这个浓度过强，有可能会消除特异性的抗体结合。

（6）细胞没有被完全裂解。推荐使用RIPA buffer裂解细胞（参考X-ChIP方法）。

（7）目标区域没有抗体被富集。 抗体结合表位不存在感兴趣的DNA区域。使用阳性对照抗体，以保证整个操作过程的正确性，如H3K4me3/H3K9me3抗体对应active/inactive promoters。

（8）不适合使用N-ChIP方法。当待测蛋白和DNA的结合比较弱或者离DNA比较远时，最好使用X-ChIP。因为交联可以避免在操作过程中蛋白质从DNA上脱落下来。而Histones通常具有很强的DNA亲和力，因此分析时常用N-ChIP。

（9）所选的单克隆抗体可能不适合X-ChIP方法。 在交联过程中，可能抗体的结合表位被封闭了。推荐使用多克隆抗体，因为具有多个抗原结合表位从而增加了IP靶蛋白的成功率。

（10）使用了错误的抗体亲和beads。 Protein A和G结合不同的Ig. 选择使用能有效结合抗体的Protein beads。推荐使用protein A和G的葡聚糖混合物从而增加沉淀抗体的成功率。

4：PCR扩增出现问题

可能原因及解决方法

（1）所有标本包括模板对照 PCR结果信号均过高。real-time PCR溶液污染了，换用新鲜配制的新溶液重新进行PCR。

（2）标本PCR结果阴性。使用 standard/input DNA确认引物是否正确。