转录因子相关调控研究案例（三）

一、    调控通路

DHT刺激细胞后，雄激素受体（AR）C-端与LncRNA PRNCR1结合，联合另一个LncRNA PCGEM1招募DOT1L将AR的A-端甲基化；LncRNA PCGEM1同时与PYGO2结合，然后LncRNA将AR和PYGO2结合到靶标基因的增强子区促进基因的表达。

二、    实验流程

作者首先用AR抗体进行RIP实验获得了与AR结合的LncRNA PRNCR1和PCGEM1，又通过CHIRP实验验证了AR与LncRNA PCGEM1以及基因组蛋白的关系，RNA pull-down验证LncRNA PRNCR1和PCGEM1结合AR；随后作者通过一系列的RNA pull-down实验验证LncRNA PCGEM1与AR、PYGO2、DOT1L的互作关系；为了说明LncRNA PRNCR1和PCGEM1参与基因的转录过程，作者对LncRNA进行敲低后检测靶标基因Mrna的表达；为了检测AR与LncRNA的结合位点，作者使用RIP实验进行验证；最后作者通过一系列的CHIP实验验证LncRNA、AR、PYGO2与靶基因启动子、增强子的互作，作者对LncRNA敲低后细胞进行CHIP实验说明PYGO2的靶基因的作用是由LncRNA介导的。

三、核心FIGURE

Figure1说明的是前列腺癌细胞特异LncRNA与雄激素受体（AR）的相互作用。

a-b、RIP实验，用AR抗体钓取前列腺癌细胞和普通畸形前列腺增生细胞中AR结合的RNA，然后进行Q-PCR检测，表明前列腺癌细胞的lncRNA PCNCR1和PCGEM1高度结合。

c、RIP实验，用AR抗体钓取经二氢睾酮处理后细胞中与AR结合的RNA，结果表明二氢睾酮诱导AR结合lncRNA PCNCR1和PCGEM1。

d、RIP实验，用AR分别钓取PCNCR1敲低，PCGEM1敲低细胞中结合的RNA，结果表明PCNCR1敲低后两种LncRNA与AR结合均下降，而PCGEM1敲低后，PCNCR1与AR的结合不受影响。

E、CHIRP实验，细胞经DHT处理后，用PCGEM1探针钓取与之结合的核酸和蛋白。

Figure2说明的是LncRNA与转录因子/共激活物的互作。

a-b、RIP，对AR进行突变，然后用Flag标签抗体钓取经二氢睾酮处理后与AR结合的RNA，结果表明AR的K631/634Q突变后，LncRNA结合明显增强，说明AR K631/634的乙酰化使LncRNA与AR相互作用增强。K349R突变后，PCGEM1结合降低表明AR结合PCGEM1需要K349的甲基化。

c、AR的体外甲基化实验，DOT1L使AR甲基化。

d、RNA pull-down，将AR分为不同片段连接到表达载体上转染细胞，然后用PRNCR1探针做Pull down，结果表明PRNCR1结合AR的区段为549-623位氨基酸之间。

e、RNA pull-down，将AR分为不同片段连接到表达载体上，与DOT1L表达载体共同转染细胞，然后用PCGEM1探针做Pull down，结果表明在AR的K349甲基化后PCGEM1与AR的N-段结合。

f、RNA pull-down，用PCGEM1全长和截短探针钓取与之结合的蛋白，然后用WB检测AR和PYGO2，表明PCGEM1结合AR的区段为411-490，结合PYGO2区段在1191-1270。

Figure3说明的是Lnc促使PRGO2和AR结合到靶标基因的增强子区促进基因表达。

A、q-pcr检测AR表达，LncRNA敲低细胞的PSA等基因的表达，表明AR的表达促进靶标基因的表达，而LncRNA敲低后靶标基因的表达下降。

B、CHIP-3C，表明PSA基因结合AR的区域。

C-D、CHIP，用PYGO2抗体钓取经HDT处理的细胞与PYGO2结合的DNA片段，然后进行Q-PCR验证，表明HDT处理后PYGO2结合到PSA基因的增强子区和启动子区。

E、CHIP-3C，表明PYGO2敲低后，结合的PSA增强子减少。

F、CHIP，LncRNA敲低后，用AR抗体钓取与蛋白结合的DNA片段然后继续Q-PCR检测，表明LncRNA敲低后AR结合靶标基因减少。

本公司可提供的技术服务项目

本公司可进行类似实验的实验设计及整体实验外包项目，包括RNA pull-down、RIP、CHIRP、WB、慢病毒稳转株的建立（过表达/敲低）、Q-PCR、CHIP，其中RIP、CHIRP、RNA pull-down、CHIP为本公司主营项目。

一、RIP：主要­­研究蛋白与RNA的相互作用

作者分别用AR抗体钓取细胞中与AR蛋白结合的RNA，然后进行q-pcr验证，结果表明LncRNA PRNCR1和PCGEM1与AR结合。我公司在实验体系中设置阳性及阴性对照，进一步排除系统误差。

二、CHIRP：检测与RNA绑定的DNA和蛋白相互作用的方法。

在本实验中，作者用PCGEM1探针钓取经DHT处理后的细胞中与PCGEM1结合的蛋白和DNA片段，然后进行Q-PCR和WB检测。

三、RNA pull-down：检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。

 用PRNCR1探针钓取纯化的MYC-标签的AR融合蛋白，然后进行WB验证，结果表明了LncRNA PRNCR与AR直接结合，结合的AR区域为549-623位氨基酸区域。我公司在实验体系中同时提供lncRNA正义链与反义链的pull down。

四、CHIP：主要研究蛋白与基因启动子之间的关系

 用PYGO2抗体钓取细胞内与PYGO2蛋白结合的DNA片段，然后进行Q-PCR检测，结果表明DHT刺激后PYGO2结合PSA基因的增强子区和启动子区，LncRNA干扰表达后结合降低。

参考文献：Liuqing Yang, Chunru Lin, Chunyu Jin,et al. lncRNA-dependent mechanisms of androgenreceptor-regulated gene activation programs［J］.Nature,2013,500(7464): 598–602